Proteínas

RESUMEN En la primer práctica lo realizado fue, tomar algunas muestras de proteínas extraídas de algunas sustancias y así reconocer su naturaleza proteica.
Las muestras tomadas fueron:

• Caseina
• Gelatina
• Ovoalbúmina
• Aspartamo
• Glicina
• Proteína de suero 

El Biuret nos permite detectar la presencia de enlaces peptídicos y el Xantoproteico restos aromáticos, así logramos determinar el carácter proteico de la caseína.
El color violeta del Biuret nos permite decir que existen por lo menos dos enlaces peptídicos.
El ensayo Xantoproteíco, la producción de un producto coloreado amarillo es una prueba de la presencia de tirosina o triptófano en la caseína.

MATERIALES Y SUSTANCIAS:

1. Vaso de bohemia
2. Varilla de vidrio
3. Mechero
4. Soporte
5. Tela metálica
6. Gradilla 
7. Tubos de ensayo
8. Termómetro
9. Papel de filtro
10. Leche descremada
11. Ácido etanoico 2,0 M
12. Hidróxido de sodio al 10%
13. Sulfato cúprico al 1%
14. Ácido nítrico
15. Ácido nítrico concentrado

PROCEDIMIENTO: (extracción)

1.  Colocamos aproximadamente 25 mL de leche descremada en un vaso de Bohemia. 
2.  Calentamos a 40ºC aproximadamente agitando con una varilla de vidrio. 
3.  Adicionamos 2,0M de ácido etanoico, gota a gota, agitando en forma continua hasta la coagulación total. 
4.  Separamos el coágulo de caseina del suero mediante filtración.  
5. Secamos cuidadosamente la caseina con la ayuda del papel de filtro.
6.  Separamos dos porciones de sólido obtenido de aproximadamente 1 cm3 y las colocamos en dos tubos de ensayos.

PROCEDIMIENTO:

(naturaleza proteica) 

1.  Mediante la reacción de Biuret agregamos en el primer tubo de cada muestra 20 gotas de NaOH al 10%. Luego agregamos 2 gotas de solución de CuSO4 al 1% y después de esto anotamos las observaciones. 

2. Mediante la reacción Xantoproteica agregamos sobre el segundo tubo de cada muestra 10 gotas de HNO3 concentrado. Esperamos un par de minutos y anotamos las observaciones.

Biuret:
El biuret está compuesto por hidróxido de potasio (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio. El reactivo que es originalmente de color azul, cambia a violeta ante la presencia de proteínas.
El hidróxido de potasio que no participa en la reacción, proporciona el medio alcalino necesario para que esto ocurra.
La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos.
Un resultado negativo en la reacción del Biuret sobre una muestra, no necesariamente indica la ausencia de proteínas, ya que puede ocurrir:

• Que no existan proteínas o péptidos en la muestra
• Que existan una o más sustancias que interfieran en la muestra e impidan que se produzca la reacción (lo que daría lugar a un resultado falso negativo)
• Que existan péptidos, pero a una concentración inferior al límite de sensibilidad del método 

Reacción del Biuret:

Xantoproteica:
Esta reacción se usa para detectar la presencia de proteínas solubles en una solución. Se realiza mediante el uso de HNO3 concentrado que cuando está en presencia de proteínas o aminoácidos con restos aromáticos torna la solución de un color amarillo oscuro.
El ácido nítrico reacciona con los núcleos aromáticos sustituyendo hidrógenos por radicales nitro (-NO2) con lo que se forman nitroderivados aromáticos del color amarillo.
La reacción xantoproteica se puede considerar como una reacción electrofilica aromática de los residuos de tirosina de las proteínas por el ácido nítrico, dando así entonces, un compuesto coloreado amarillo a pH ácido.

(El resultado de un producto coloreado de amarillo al añadir ácido nítrico, es una prueba para la presencia de tirosina o triptófano en una proteína)

Muestra                                   Biurer                                 Xantoproteico
Caseina                                    +                                       +
Gelatina                                    +                                       -
Ovoalbumina                            +                                       +
Aspartamo                                -                                       -
Glicina                                      -                                        -
Proteína del suero                     +                                       +

Caseína: Es una proteína de carácter ácido debido a su elevada proporción de aminoácidos ácidos (pH=4,6).
Reacciona con las bases formando caseinatos utilizados en la industria para la fabricación de colas y adhesivos. También se utiliza en la industria textil.
La caseína precipita por acción de los ácidos. Esto puede ocurrir a través de las formulación de ácido láctico por la acción bacteriana sobre la lactosa o mediante el agregado de un ácido hasta alcanzar el pH correspondiente a su punto isoeléctrico. La precipitación puede producirse por la acción enzimática de la quimiotripsina.

Gelatina: La gelatina es una mezcla coloide (sustancia semisólida), incolora, translúcida, quebradiza e insípida, que se obtiene a partir del colágeno procedente del tejido conectivo de despojos animales hervidos con agua. El colágeno es un componente abundante en piel, tendones, sistema vascular y otros materiales de desecho, de donde se puede obtener la gelatina comercial, que es un producto de degradación parcial del colágeno, extraida por calentamiento tras un tratamiento en medio ácido o alcalino. La gelatina es una proteína compleja, es decir, un polímero compuesto por aminoácidos. Como sucede con los polisacáridos, el grado de polimerización, la naturaleza de los monómeros y la secuencia en la cadena proteica determinan sus propiedades generales. Una notable propiedad de las disoluciónes de esta molécula es su comportamiento frente a temperaturas diferentes: son líquidas en agua caliente y se solidifican en agua fría.
Desde el punto de vista nutricional, el colágeno y aún más la gelatina, son proteínas muy desequilibradas en cuanto a su composición de aminoácidos. El colágeno es muy deficiente en triptófano, y la gelatina prácticamente carece de él, ya que el poco que existía se suele destruir en su preparación. La facilidad con la que se proteoliza depende mucho de su estado. El colágeno nativo es bastante resistente a la proteolisis por parte de la mayoría de las proteinas, mientras que el colágeno desnaturalizado se hidroliza fácilmente.

Podemos observar entonces que la solución es incolora con Xantoproteica, por lo tanto la prueba da negativa y sabemos que la gelatina no tiene tirosina o triptofano.

Ovoalbumina: Las proteínas de la clara de huevo entran dentro de la definición de glicoproteínas, que son proteínas que llevan enlazados contenidos diversos de glúcidos a la cadena de aminoácidos. Entre éstas, la más abundante es la ovoalbúmina, que es una fosfoglicoproteína.  La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo y la que le da sus propiedades características (junto con la otra albúmina no fosforada). La ovoalbumina es, pues, una fosfoglicoproteína de 385 restos de aminoácido con un peso molecular aproximado de unos 42.7 KDa. Es una proteína de referencia en bioquímica y es conocida a la industria alimentaria por sus propiedades como transportadora, estabilizadora y formadora de emulsiones. Se desnaturaliza por calor a los 78ºC (temperatura de semidesnaturalización) perdiendo su estructura replegada de albúmina y produciendo un gel con gran retención de agua.

Aspartamo: El aspartamo es un edulcorante no calórico,es estable cuando se encuentra seco o congelado, pero se descompone y pierde su poder edulcorante con el transcurso del tiempo, cuando se conserva en líquidos a temperaturas superiores a 30 °C. La dulzura relativa del aspartamo es de 150 a 200 veces más dulce que el azúcar. Es necesario destacar que todos los edulcorantes se clasifican con respecto a la sacarosa o azúcar común, por lo que el valor de 200 veces es obtenido en comparación con diluciones hechas en laboratorio de sacarosa.

En el caso del aspartamo ambos ensayos dieron negativos, por tanto no presenta tirosina o triptofano o por lo menos dos enlaces peptídicos.


Glicina: La glicina es uno de los aminoácidos que forman las proteínas de los seres vivos. Es el aminoácido más pequeño y el único no quiral de los 20 aminoácidos presentes en la célula. Su fórmula química es NH2CH2COOH y su masa es 75,07. La glicina es un aminoácido no esencial.
La glicina se utiliza -in vitro- como medio gástrico, en disolución 0,4 M, amortiguada al pH estomacal para determinar bioaccesibilidad de elementos potecialmente tóxicos (metales pesados) como indicador de biodisponibilidad. Es el más soluble.

El mismo caso que aspartamo, en la glicina ambos ensayos dieron negativos, por tanto no presenta tirosina o triptofano o por lo menos dos enlaces peptídicos.


Proteína del suero: Sus características corresponden a un líquido fluido, de color verdoso amarillento, turbio, de sabor fresco, débilmente dulce, de carácter ácido, con un contenido de nutrientes o extracto seco del 5,5% al 7% provenientes de la leche.
Desde el punto de vista químico es una mezcla de proteínas como la beta-lactoglobulina, la alfa-lactoalbumina , y la seroalbúmina , todas ellas solubles en agua en sus formas nativas independientemente del pH de la solución.

Diálisis: (Fundamento teórico) La diálisis es una técnica común de laboratorio, y funciona con el mismo principio que la diálisis médica.
Una solución de varios tipos de moléculas es puesta en un bolso semipermeable de diálisis, como por ejemplo, en una membrana de la celulosa con poros, y el bolso es sellado. El bolso de diálisis sellado se coloca en un envase con una solución diferente, o agua pura. Las moléculas lo suficientemente pequeñas como para pasar a través de los poros (a menudo agua, sales y otras moléculas pequeñas) tienden a moverse hacia adentro o hacia afuera del bolso de diálisis en la dirección de la concentración más baja. Moléculas más grandes (a menudo proteínas, ADN, o polisacáridos) que tiene dimensiones significativamente mayores que el diámetro del poro son retenidas dentro del bolso de diálisis. Una razón común de usar esta técnica puede ser para quitar la sal de una solución de la proteína.

MATERIALES:

1.  Dializador (gomita elástica, botella cortada, papel celofán)
2. Ovoalbúmina en solución más NaCl 
3.  AgNO3 (Nitrato de Plata)  
4. CuSO4 al 1 % 
5.  NaOH al 10% 
6. Cristalizador 
7.  Agua destilada

PROCEDIMIENTO: Primero se coloca en agua destilada en el critalizador, y luego agregamos el destilador al cristalizador también. Seguido de esto se coloca la solución de ovoalbúmina con el NaCl dentro del dializador y se deja por unos minutos
.Una vez hecho esto se coloca una muestra del exterior del critalizador y una del interior. Se coloca cada una en tubos de ensayos distintos. Para finalizar se le agrega a la misma muestra del exterior y del interior Biuret y lo mismo con el AgNO3. Se anotan los resultados.


AgNO3           Ag+    +     NO3-
                Catión Plata      Anión Nitrato

 NaCl              Na+     +    Cl-
               Catión Sodio   Anión Cloruro


 Para luego: Ag+   +    Cl- = AgCl
                                    Cloruro de Plata

RESULTADOS: El ensayo de biuret nos ayuda a comprobar que la muestra del exterior del dializador resulta ser negativa, lo cual indica que las moléculas de ovoalbùmina no pasaron la membrana. En cambio con el ensayo de AgNO3 y Cl- logramos ver, que en este caso ocurrió todo lo contrario y las moléculas en este caso, lograron traspasar la membrana.
En ambos casos las muestras tomadas del interior del dializador fueron resultados positivos.
El color blanco del AgNO3 nos ayuda a demostrar que hay sales que no pasan la membrana y en el caso del violeta para biuret, significa que las proteínas no se movieron del dializador.

MUESTRA          Cl- (con AgNO3)               Proteína con Biuret
Interior                            +                                       +
Exterior                           +                                       -